Maznica Dmitrij Alekseevic

Генетика, 3 years in practice

Doctor's rating

5

Разработка методики установления ВИЧ-протективного генотипа эмбриона человека в клинике ЭКО, для профилактики вертикальной передачи ВИЧ

Работа выполнена на базе отделения репродуктологии МОНИАГ, клиники «Семья», института иммунологии

Борьбы с ВИЧ-инфекцией, последнее время, является одной из приоритетных задач ВОЗ. Эпидемия ВИЧ-инфекции продолжается и к настоящему времени сообщается об инфицировании около 40 млн. человек.

Изобретение и внедрение в клиническую практику ВААРТ привело к кардинальному изменению течения ВИЧ-инфекции. Ранее с момента инфицирования до летального исхода проходило в среднем около 12 лет. Сейчас в развитых странах средняя ожидаемая продолжительность жизни ВИЧ-инфицированных начинает выравниваться со среднем значением по населению.

ВИЧ-инфекция становится хроническим заболеванием, как например, СД, и ВИЧ-инфицированные люди начинают планировать собственную жизнь, в том числе и рождение детей.

В настоящее время разработаны рекомендации о применении методов ВРТ у ВИЧ-инфицированных, в том числе в серодискордантных парах (где один из партнеров ВИЧ+, другой ВИЧ-).

 

Предимплантационная генетическая диагностика – популярный сегодня метод неинвазивного скрининга в клиниках репродукции. Проводится она после процедуры ЭКО, эмбрион содержится 5-е суток затем биоптируется 1 клетка и направляется на анализ (чаще всего кариологический).
Показаниями к ПГД являются вероятные хромосомные абберации или риск наследования моногенных заболеваний.

Следующий тезис: существование ВИЧ-протективных генов, которые тем или иным образом препятствуют развитию ВИЧ-инфекции или прогрессированию СПИДа. Например продукты генов CCR5 или CCR2 – это хемокиновые рецепторы различных типов участвующие в инфицировании CD4 лимфоцитов.

Белок CCR5, продукт наиболее изученного ВИЧ-протективного гена. Это трансмембранный белок который участвует в связывание  CD4-клетки и вирусной частицы. У части населения северной европы, а также других стран, встречается мутация дельта 32. Гомозиготы по это этой мутации полностью не восприимчивы к ВИЧ инфекции, то есть не могут заразиться ни одним из известных механизмов передачи. Этот факт научно доказан.

По известным на сегодняшний день данным наибольшее количество носителей ВИЧ-протективного аллеля CCR5-гена в мире сосредоточено в северной европе, и Россия здесь не является исключением. На данном слайде представлено графическое изображение распространенности ВИЧ-протективного аллеля на территории РФ и сопредельных государств. Видно уменьшение встречаемости с северо-запада на юговосток.

Основываясь на представленных научных тезисах, нами была выдвинута идея о создании тест-систем.

Цель была сформулирована следующим образом: Разработать технологию проведения генетического анализа эмбриона человека по одной клетке и провести генетическое обследование эмбрионов для установления частоты встречаемости ВИЧ-протективного генотипа по аллелю ССR5delta32, а также подтверждения аналитических характеристик разработанного метода.

Задачи для достижения данной цели:

Провести анализ литературных данных об использовании технологий ВРТ и ПГД у ВИЧ-инфицированных.

Провести набор клинического материала (биоптаты человеческих эмбрионов).

Провести адаптацию технологии генетического анализа для возможности оценки генотипа по одной клетке.

Подтвердить аналитические характеристики разработанной методики.

Провести обследование собранных образцов на наличие полиморфизма ССR5delta32

 

Анализ литературных данных показал что в мире проводилось несколько работ по оценки методов ВРТ у ВИЧ-инфицированных. Также мы обнаружили что ПГД у пациентов практически не выполнялось.

В литературе не встречалось ни одно упоминание про использование ПГД для определения полиморфизмов ВИЧ-инфицированных

Материалы и методы. На первом этапе мы проводили биопсию эмбриона 5-х суток. Подробный протокол представлен на слайде. Самым сложным этапом этой процедуры является разрушение блестящей оболочки, которое в данном случае проводилось высокоэнергитическим лазером.

С целью адаптации технологии, для возможности анализа генотипа по одной клетке генотипирование проводилось в 2 этапа. Адаптация включала изменение процедуры забора материала (забор проводился в фосфатный буфер) и введение в протокол процедуры полногеномной амплификации для увеличения количества генетического материала. Протокол был был проведен по схеме представленной на данном слайде. Использовались гексамерные праймеры для увеличения содержания молекул ДНК в образце. Далее проводился ПЦР-анализ изучаемых генов в реальном времени, визуализация была проведена с помощью аллель специфических проб. В настоящем исследовании использовался ПЦР с оценкой температуры плавления дуплексов синтетических аллель специфических проб и ДНК мишени.

 

Так на картинке представлены графики - результаты исследований генотипов бластомеров из клиники. В первом исследовании один из эмбрионов гомозиготен по делеции, то есть не восприимчив к ВИЧ. Во втором исследовании была обнаружена гетерозигота.

В качестве референсного метода определения генотипа образцов использовали секвенирование по Сэнгеру. Секвенировали один образец каждого генотипа.

При создании праймеров пользовались алгоритмом BLAST Национального центра биотехнологической информации США. Для оценки вероятности формирования и стабильности вторичных структур на выбранных участках генома пользовались алгоритмом Mfold. Всего в исследовании проводилась биопсия 13 эмбрионов. Тест-система показала свою эффективность и специфичность при     проверке различными методами, такими как секвенирование и       анализ баз данных. Самое важное что Воспроизводимость результатов составила 100%. Был установлен генотип 13 эмбрионов. Частота встречаемости аллеля CCR5delta32 на исследованном материале составилa 0,15±0,7

Выводы:

В настоящее время в мире не проводится генотипирование эмбрионов для поиска ВИЧ-протективных генов.

Разработанная методика определения генотипа эмбриона по ВИЧ-протективному полиморфизму гена CCR5 может быть основана на стандартной технологии забора клинического материала, используемой при ПГД.

Разработанная методика характеризуется высокой эффективностью, специфичностью и воспроизводимостью, что позволяет рекомендовать ее для установления генотипа эмбриона по одной клетке.

Проведенный анализ встречаемости аллеля CCR5delta32 на обследованной выборке показал сходные с другими исследованиями значения.

Перспективы:

Создание первой тест-системы для определения ВИЧ-протективного генотипа

Фундаментальное изучение механизмов передачи ВИЧ от матери к плоду при наличии ВИЧ-протективного генотипа у плода

Фундаментальное изучение генотерапии эмбрионов

Клиническое применение новых протоколов в ПГД диагностике, а также, расширение показаний к ПГД в клиниках репродукции человека.

Share:

3 July 2016, 12:31

Другие материалы по тэгам:

Анализ

Заболевание

Топик


Рекомендуемая статья:

Скрининги беременных